菠萝蛋白酶的提取、初步纯化及活性测定

为了吸引眼球先写个小插曲,实验室配制很多溶液都需要搅拌摇匀,为了节省人力自然就有搅拌机器,但是我以前只看到过那种一个托盘摇来摇去那种,这种梯度混合仪还真第一次见,而且还很好玩,原理大体是在溶液里放入白色的带磁性的长条颗粒,然后机子的磁极变换就会使得它旋转起来,自然就能搅拌了,这种比起以前的机器自然又是先进了。

上周五做的生化大实验是对菠萝提取蛋白酶,然后就简单纯化一下。

在之前我还专门查阅了很多文献,发现菠萝蛋白酶的提取以前的方法是用单宁(一种生物碱)来沉降,现在我们实验室做的方法是盐析法,然后用透析法来提纯,还有更先进的方法是超过滤。

但老师上课时告诉了我们,其实现在工业上生产还是用单宁来制备,十年前他去广西一带,带回来一桶菠萝蛋白酶(是糊状的,就是平时油漆桶大小),价钱是400块钱十公斤;而后来他从国外进口的菠萝蛋白酶(是干粉状的,纯度更高)则达到2000块钱1克,前后价格竟然相差5万倍,可想而知,提纯这东西是比较复杂难搞的,只要你的纯度提高那么一点,价格就是天翻地覆;但是现在我们国内一般还是生产这种糊状的,不禁让人有点尴尬啊。

这个实验我们用硫酸铵来盐析出蛋白,关于盐溶盐析就不解释了。

首先是削菠萝,其实提取菠萝的蛋白酶,只需要用到菠萝皮就足够了,菠萝肉当然是我们吃了哈哈。把菠萝皮放进榨汁机,榨汁时加入PBS溶液(磷酸盐缓冲液),然后用纱布过滤,这时就得下下面的这个菠萝汁啦。

菠萝蛋白酶的提取、初步纯化及活性测定

然后拿去离心,这步是为了弃除一些没用的残渣。

菠萝蛋白酶的提取、初步纯化及活性测定

然后加入30%饱和时需要的量的硫酸铵,导入离心管,放去冰箱4°C水浴两个小时,这是当然是去吃午饭啦,回来就可以继续做了。

水浴完就是又离心一次,这次得到的上下清液都要保留,上清液作为A液,下清液再加入PBS溶解作为B液,这两组要用做对蛋白酶的活性检测。

菠萝蛋白酶的提取、初步纯化及活性测定

菠萝蛋白酶的提取、初步纯化及活性测定

活性检测的原理是,菠萝蛋白酶可以将酪蛋白水解成酪氨酸,而酪氨酸的紫外吸光度与含量有关,所以我们可以用分光光度计来间接比较A、B液中哪个的蛋白酶活性更强。

菠萝蛋白酶的提取、初步纯化及活性测定

菠萝蛋白酶的提取、初步纯化及活性测定

菠萝蛋白酶的提取、初步纯化及活性测定

菠萝蛋白酶的提取、初步纯化及活性测定

测定出哪个的活性更高后,最后一步就是透析去盐。把溶液倒入透析袋,夹好夹子,透析自然是要定时地更换透析液的。透析完就可以放入冰箱保活。等待下次实验的需要。

菠萝蛋白酶的提取、初步纯化及活性测定

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